В русской народной сказке «Царевна-лягушка» Василиса Премудрая регулярно сбрасывает лягушачью кожу для того, чтобы принять на время человеческий облик и выполнить при этом всевозможные задания на конкурсе жен, который устраивает ее свекор — отец царевича Ивана. Пока она печет хлеб, ткет за одну ночь ковер и поражает всех присутствующих своими фокусами на пиру, лягушачья кожа лежит в укромном месте, сохраняя при этом полную жизнеспособность. Конец этим переодеваниям кладет ее супруг, опрометчиво решивший бороться не с причиной странных превращений своей жены в лягушку, а с их внешними проявлениями. Он сжигает кожу в печи, что вынуждает Василису отправиться в царство мертвых к Кащею Бессмертному. Излагая эту ситуацию в терминах современной медицины, можно сказать, что Василиса в образе лягушки получает термальный сверхкритический ожог, который для нее является несовместимым с жизнью.

В сказке все заканчивается хорошо. В конце концов Иван вызволяет свою супругу из кащеева плена т.е. его реанимационные усилия по освобождению Василисы из объятий смерти заканчиваются полным успехом. К сожалению, в реальной жизни борьба с повреждениями больших площадей кожи человека часто заканчивается не столь удачно. Дело в том, что она — древнейший орган защитной системы, постоянно оберегающий клетки нашего тела от вторжений бактериальных кочевников. Нарушение целостности кожного покрова на значительных участках поверхности можно сравнить с разрушением крепостной стены средневекового города при осаде его неприятелем сразу в нескольких местах. Немудрено, что в образовавшиеся бреши кидаются болезнетворные микроорганизмы. Через рану выделяются в больших количествах белок, плазма крови, теряются необходимые электролиты. Если же учесть болевой шок и отравление организма продуктами распада поврежденных тканей, становится ясно, почему смертельно опасны ожоги, затрагивающие всего лишь около трети поверхности тела человека.

Вот если бы можно было уподобиться сказочной Василисе и в критической ситуации с легкостью надеть на себя новую кожу, которая до поры хранилась отдельно, то многие проблемы ожоговой терапии были бы решены. Между тем такая ситуация — уже не фантастика. На протяжении нескольких лет в Англии, Германии, США, Франции, Чехии, Словакии, Японии и России вполне успешно осуществляются подобные операции. Для их проведения необходимо было научиться выращивать клетки кожи вне тела человека, как говорят ученые, in viro.

Первые попытки сохранить живые кусочки человеческой кожи вне организма были предприняты еще в XIX в. Люинггреном. Он брал их у доноров-добровольцев и содержал некоторое время в питательной жидкости, которая была составлена на основе солей, плазмы крови и глюкозы. В таких условиях кожные лоскутки оставались некоторое время жизнеспособными и успешно приживались после пересадки на прежнее место. Ясно, что для закрытия больших раневых поверхностей кожи такой способ явно не годился. Для успеха подобных операций необходимо было уметь не просто вырезать куски здоровой кожи и сохранять их жизнеспособность, а научиться выращивать новые пласты большой площади из отдельных клеток кожи.

Успехи современной биологии позволяют культивировать вне организмов сотни различных типов клеток многоклеточных существ. Проблема в том, чтобы найти и выделить именно те клетки человека, за счет которых образуется его внешний кожный покров. А это не так просто, поскольку кожа — сложное образование, состоящее из нескольких клеточных слоев. Образно ее можно сравнить с домом, построенным из клеток—кирпичей.

Подвалы этого дома образуют самые глубокие части кожи, так называемую дерму. Там. среди переплетения различных коммуникаций — кровеносных сосудов и нервных окончаний, — обитают клетки фпбробласты, выделяющие белок коллаген. Три полипептидные цепи молекулы коллагена образуют длинные спирально закрученные пучки коллагеновых микрофибрилл, отдаленно напоминающих веревки. Те, в свою очередь, соединяются в более мощные образования — коллагеновые волокна, похожие на толстые морские канаты. Эти волокна окружены менее плотно соединенными белками и полисахаридами, которые тоже выделяются фибробластами. В целом получается структура, которую биологи называют внеклеточным матриксом. По своему строению матрикс напоминает железобетон, где жесткий металлический каркас залит менее прочным цементом. Фибробласты и матрикс с коллагеновыми волокнами образуют соединительную ткань — прочную основу, на которой уже можно возводить клеточные стены верхних слоев кожи — эпидермиса.

Образование эпидермиса похоже на возведение кирпичной кладки с той лишь разницей, что на обычной стройке новые слои кирпичей кладут поверх старых, уже положенных. В эпидермисе все происходит наоборот. Самые старые клетки лежат наверху, а новые образуются внизу, как раз на границе дермы и эпидермиса. Там находятся так называемые базальные, или, как их еще называют, стволовые, клетки кераптноциты, которые постоянно делятся. Это их основная работа. В неповрежденной коже они образуют сплошной слой, который лежит поверх дермы на специальной подложке — базалыюй мембране .В результате деления кератиноцитов вновь образующиеся клетки сначала сдвигаются к краям от места деления, а потом оказываются сверху базального слоя, поскольку деться им больше просто некуда. Потерян контакт с дермой, они утрачивают способность к делению и начинают вместо этого производить кератин -основной белок волос, перьев, рогов и копыт. Молодые делящиеся кератиноциты постепенно оттесняют своих родственников все дальше от дермы, и последние, словно на переполненном эскалаторе, начинают долгий путь к поверхности кожи. При этом клетки эпидермиса постепенно меняют свою форму, становясь все более плоскими. Недели через две они превратятся в ороговевшие мертвые чешуйки, состоящие почти из одного кератина. Оказавшись на поверхности, они навсегда отделятся от тела, чтобы уступить дорогу другим клеткам, уже поднимающимся из глубин эпидермиса.

Из сказанного ясно, что для выращивания эпидермиса вне тела человека нужно заполучить стволовые базальные клетки кератиноциты, а остальное они сделают сами. Можно попытаться решить эту задачу, что называется, «в лоб» — сначала вырезать под местной анестезией из кожи с помощью специального приборчика дерматома («кожереза») небольшой лоскуток толщиной около трети миллиметра, а затем разобрать его на отдельные клетки, обработав ферментами, которые нарушают клеточные контакты.

К сожалению, этот метод мало что дает. Подобные лоскутки содержат не только базальные клетки эпидермиса и их производные, но и фибробласты. Последние же делятся быстрее, чем кератиноциты. и очень скоро «забивают» их при выращивании in viro. В общем, если посеять нежные культурные растения вместе с их более шустрыми и устойчивыми к погодным условиям собратьям-сорнякам, хорошего урожая сразу двух видов не жди. Следовательно, задача сводится к тому, чтобы отделить зерна от плевел — иначе говоря, нужно получить стволовые клетки эпидермиса в чистом виде.

Подобную задачу впервые успешно решили в 1975 г. американские биологи Д. Рейнвальд и Г. Грин. Они обработали небольшие кусочки кожи специальным микробным ферментом диспазой, которая специфически разрушала материал базальной пластинки, позволяя тем самым отделить дерму от эпидермиса. Мешающие такому разделению пучки коллагена дополнительно «обкусывались» ферментом коллагеназой, которую обычно выделяют из микробов. В растворе коллагеназы и диспазы лоскутки кожи достаточно быстро расслаивались на две части, одна из которых состояла из фибробластов и коллагена дермы, а другая содержала базальные кератиноциты и все произведенные ими клеточные слои эпидермиса. Дермальные части удалялись, а кусочки, содержащие кератиноциты, обрабатывались трипсином и соединениями, связывающими ионы кальция. В результате разрушались межклеточные контакты, базальные клетки отслаивались и попадали в раствор (наверное, нелишне будет упомянуть, что все эти процедуры проводились в стерильных условиях при температуре человеческого тела). Просеяв выделенные клетки через нейлоновый фильтр и отмыв их от трипсина, можно было получить отличный клеточный материал для выращивания искусственной кожи.

Выделение фракции базальных кератиноцитов было лишь частичным решением проблемы. Многие клетки нашего тела похожи на высокопрофессиональных специалистов. Они прекрасно выполняют определенную работу, но при этом нуждаются в постоянных кормежке и уходе, которые обеспечивают их соседи. Изолированные кератиноциты напоминали в этом плане пойманных экзотических зверьков, которых надо было научиться содержать в пластиковых вольерах, да еще и стимулировать к размножению. Для этого культуральная среда должна содержать соли, аминокислоты, витамины, коферменты, гидрокортизон, трансферрин для переноса ионов железа и еще целый ряд соединений, без которых кератиноциты in viro.чувствуют себя плохо. Вызвать их деление удавалось эпидермальным фактором роста, выделяемым из слюнных желез мышей, и холерным токсином, который добавляли в среду в сверхмалых концентрациях.

Однако этого все равно оказалось недостаточно для обеспечения кератиноцитам комфортного существования вне организма. В ткани любая клетка окружена соседями, многие из которых не только подпитывают ее, но и помогают ориентироваться в пространстве, одновременно подсказывая, что надо в таком окружении делать. Для кератиноцитов такие соседи — фибробласты, расположенные в дерме и выделяющие коллаген, фибронектин и другие белки. В пластиковом сосуде подобной дружеской поддержки не найдешь — мы же только что избавились от быстро размножающихся фибробластов с помощью диспазы и коллагеназы!

Проблема возникает, на первый взгляд, вроде неразрешимая. Без фибробластов кератиноцитам in viro.плохо, а выращивать их вместе с фибробластами нельзя, поскольку первые быстро вытесняют последних. Более того, выделение фибробластов из организма— процедура тоже достаточно тонкая, и проводить ее параллельно с получением кератиноцитов настолько же непросто, как и шеф-повару одновременно готовить два разных фирменных блюда.

Биологи придумали элегантное решение этой головоломки. Они заранее добавляют в приготовленный для культивирования кератиноцитов сосуд так называемые трансформированные фибробласты. Так называют выделяющие коллаген клетки, которые могут без особых проблем неограниченно долго размножаться in viro.. Следовательно, в лаборатории их всегда можно держать под рукой. Такие клетки получают, подвергая фибробласты действию гамма-лучей, а дозу облучения подбираю' такую, чтобы трансформированные фнбробласты еще оставались живы, но уже навсегда утратили способность к делению. В результате получаются так называемые фидерные клетки (по-русски — «кормилки»).

Лежа на своеобразном матрасе из белков, наработанных фидерными клетками, кератиноциты начинают бодро делиться. Разделившиеся клетки друг на друга до поры не наползают, а стараются найти свободное местечко по соседству. Там они распластываются, набираются сил и снова делятся. Так происходит до тех пор, пока вся поверхность культурального сосуда не зарастет сплошным слоем кератиноцитов. Внимательный читатель легко предугадает ход дальнейших событий. Вновь образовавшиеся в результате очередного деления кератиноциты окажутся на «спинах» своих родителей, что и послужит им непосредственным стимулом к началу дифференцировки и постепенному образованию всех слоев эпидермиса — так называемому процессу стратификации. В результате недели через две дне сосуда образуется тончайшая практически прозрачная пленочка кожи, выросшей вне организма!

Кстати сказать, примерно по такому же сценарию развиваются события и при естественном заживлении небольших повреждений кожи. Любой кератиноцит, только что возникший в результате деления стволовой клетки, старается прежде всего проверить, нет ли рядом свободного места, где можно было комфортом распластаться на слое фибробластов. В ране с утраченным эпителием и обнаженной дермой таких мест полно. В результате кератиноциты будут выползать из краев раны и двигаться к ее центру, пока не затянут дерму своими телами целиком. А дальше снова начнется образование слоев эпидермиса.

Если же площадь обнаженной дермы окажется слишком большой и расползающиеся кератиноциты не успеют в разумные сроки закрыть рану своими телами, организм отреагирует на такую проволочку. Он начнет «заливать» рану цементом коллагена. Причем если коллаген в дермальном матриксе уложен красиво и правильно, то в случае заделки раны уже не до архитектурных тонкостей. В результате образуется некрасивый гипертрофический келлоидный рубец, обычно выступающий над поверхностью кожи словно нарост на коре дерева. Более того, порой ремонтники-фибробласты входят в такой авральный раж. что начинают бесконтрольно делиться, и в результате образуется опухоль. Если же этого, по счастью, не случится, вполне вероятно, что позже гипертрофический рубец (который все же лучше, чем открытая брешь для микробов) превратится в атрофический — белесый и столь же неэстетичный.

Следовательно, выращивая кожный лоскут вне тела человека, мы просто помогаем организму справиться с объемом восстановительных работ, которые не укладываются в отпущенные природой сроки. Кстати сказать, время образования такого лоскута из культивируемых in viro кератиноцитов — две недели — почти в точности соответствует времени, которое необходимо организму и врачам, чтобы подготовить ожоговую поверхность к приему новой кожной одежки.

Первым делом надо вывести пострадавшего из состояния ожогового шока и осторожно произвести некрэктомию — т.е. удалить омертвевшие ткани. Делать это надо так. чтобы свести кровопотерю к минимуму. Лучше всего для подобного иссечения использовать хирургические лазеры, поскольку при их работе не образуется кровоточащих разрезов. К сожалению, такой способ на практике применяется нечасто в силу его дороговизны. Обычно же при некрэктомии для остановки кровотечений врачи используют так называемые гемостатические средства: перекись водорода, фибриновый клей, адреналин, тромбин или смесь последних двух препаратов.

Необходимо также избавиться от бактерий, которые могли попасть в рану. Последняя задача осложняется тем, что живые кератиноциты очень чувствительны к йоду и хлорсодержащим антисептикам. Именно поэтому, кстати, рекомендуют обрабатывать йодом только края раны. С другой стороны, пенициллин и стрептомицин, наиболее часто применяемые при культивировании кератиноцитов, обычно оказываются бессильны перед патогенной микрофлорой раны. Те же антибактериальные препараты, которые оказываются в этой ситуации эффективными, например сульфамилон, полиспорин и бацитрацин. как назло, задерживают рост кератиноцитов in viro. Приходится врачам изворачиваться и находить такие антибиотики, которые и микробов убивают, и пересаженным клеткам кожи расти не мешают. Например, это могут быть неомицин сульфат, полимиксин, норфлоксацин или нистатин.

После благополучной подготовки раны для пересадки дно пластикового сосуда с культивируемыми клетками вырезается обычным приборчиком для выжигания по дереву. Кожный лоскут отделяется от слоя фидерных клеток и образованного им коллагена с помощью все той же диспазы. Поскольку в руки лоскуток толщиной в 8—12 клеток взять нельзя, сверху к нему прижимают специальную парафинизированную марлевую повязку, к которой этот лоскут и прилипает. Затем такая повязка накладывается клетками на рану и через некоторое время нас ожидает чудо — под ней появляется бледно-розовая младенческая кожица, которую можно прикрывать до полного восстановления уже обычными марлевыми повязками. Через год пересаженная и натуральная кожи пациента по структуре почти не различаются. Никаких швов и стыков практически тоже не видно!

У нас в стране культивированием эпидермальных клеток in viro.И выращиванием кожных лоскутов вне организма успешно занимаются в Москве (Институт биологии развития РАН) и Санкт-Петербурге (Институт цитологии РАН и кафедра термических поражений Военно-медицинской академии). Выращивание человеческой кожи вне организма— процедура не дешевая. Выращивание 1 см2 пласта кожи обходится в 7—8 долларов. Нередко же площадь термических поражений у человека достигает нескольких тысяч квадратных сантиметров. Нетрудно подсчитать, во что обойдется латание такой бреши. К тому же вес процедуры по выращиванию кожи и по ее пересадке требуют усилий высококвалифицированных специалистов.

Может, проще воспользоваться уже готовым естественным материалом? Ясно, что при больших площадях поражений пересаживать кожу самого больного на обожженные участки бессмысленно. Такое оправданно лишь при тонких косметологических операциях, когда хирург работает всего с несколькими квадратными сантиметрами эпидермиса. Нельзя ли воспользоваться трупным материалом? Однако в этом случае велика вероятность навредить пациенту. Где гарантия, что клетки кожи еще живы и они не станут источником дополнительной бактериальной инфекции? Да и найти в нужный момент подходящий трупный материал непросто. Более того, даже если он найдется, воспользоваться им не удастся. Трупное донорство и нашей стране запрещено указом президента. К тому же через несколько часов после клинической смерти кожа трупа для пересадки уже не годится — она умирает. Необходимо также учитывать, что если даже все сроки были бы соблюдены, а бюрократические рогатки успешно преодолены, через некоторое время такой пересаженный лоскут будет неизбежно отторгнут иммунной системой реципиента.

В случае же искусственно выращиваемых лоскутов кожи такого не происходит, даже если материал взят не от самого пациента, а от другого лица, т.е. когда речь идет не об аутологичной. а о так называемой аллогенной трансплантации. Дело в том, что иммунная система человека, сталкиваясь с пересаженной чужеродной кожей, реагирует в основном на клетки Лангерганса. Они находятся в дерме, происходят из костного мозга и похожи на амеб. При выделении суспензии кератиноцитов клетки Лангерганса теряются и следовательно, отторжения выращенного и пересаженного лоскута эпидермиса впоследствии не происходит. Учитывая сказанное, все-таки во всех отношениях выгоднее пересаживать кожу, выращенную in viro., чем брать ее от трупов. Как говорится, «дорого — да мило, дешево — да гнило»! Тем более что в первом случае можно поставить производство кожи на поток.

Действительно, представим себе, что, выбрав молодого здорового и симпатичного донора, мы взял г всего 1 см2 его кожи и выделили из этого скромного кусочка все кератиноциты. Через несколько дней культивирования in viro.эти клетки будут занимать площадь уже около 1 м2. Далее нетрудно подрощенные кератиноциты смыть с поверхности сосуда и, расфасовав по сотням пластиковых пробирок, заморозить в жидком азоте (процедура в современной биологии вполне рутинная). Тем самым создается банк клеток кожи, которыми можно воспользоваться в любой момент. Достаточно, получив сигнал от медиков об очередном несчастном обожженном, разморозить всего одну такую пробирку и перенести ожившие кератиноциты в культуральный сосуд с фидерными клетками, и к моменту операции для него будет готов кусок эпидермиса нужного размера.

Не исключено, что в скором времени удастся замораживать и хранить не только клетки, но и целые лоскуты кожи, выращенные in viro.. Такой замороженный эпителий нетрудно доставить на обычных рейсовых самолетах в любую точку страны за считанные часы.

Можно, впрочем, пойти и другим путем — создать при институтах скорой помощи, крупных клиниках и ожоговых центрах небольшие лаборатории, постоянно занимающиеся выращиванием кожного материала для пересадок. К сожалению, потребность в нем будет всегда. По данным Всемирной организа¬ции здравоохранения (ВОЗ), среди всех видов травм ожоги занимают печальное третье место, а в некоторых странах (например, Японии) даже второе.

Пересадки выращенной вне тела человека кожи — не частный случай успехов науки на стыке медицины и клеточной биологии. Речь по сути идет о начале новой эры в лечении травм, заболеваний и пороков человека — заместительной клеточной терапии, или, как ее называют американцы, тканевой инженерии. Возможно, недалеко то время, когда в специальных крио-банках будут храниться на всякий случай образцы клеток различных тканей каждого жителя планеты, взятых у него еще при рождении. Уже сегодня в лабораториях мира успешно выращиваются человеческие хрящи и связки, костные и мышечные ткани. Впрочем, это уже начало другого рассказа.

С. Афонькин, М. Битой